Propriétés

Physico-Chimiques

de Colorants Organiques

 

 

 

 

 

 

 

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Mémoire de Stage de M1 Physique et Ingénierie effectué au Laboratoire de Spectrométrie Physique (LSP) du 3 avril au 30 juin 2006

par Souny YEM

 

Maître de Stage : Jean-Claude VIAL

Table des matières

 

1 Introduction.. - 3 -

1.1 Présentation du laboratoire. - 3 -

1.2 Analyse de la micro vascularisation cérébrale de la souris par microscopie non linéaire. - 4 -

2 Position du problème physique.. - 7 -

2.1 Introduction du Coefficient de Partage. - 7 -

2.2 La Barrière Hémato Encéphalique (BHE). - 8 -

3 Travail effectué.. - 9 -

3.1 Méthodes d’estimation des logK... - 9 -

3.2 Détermination expérimentale des log K... - 12 -

3.3 La Spectrophotométrie UV-VIS (*) - 14 -

4 Discussion.. - 23 -

4.1 Observations et remarques. - 23 -

4.2 Les Tensioactifs. - 25 -

5 Ouverture.. - 27 -

5.1 Observation de la diffusion des colorants à travers la membrane de vésicules  - 27 -

Annexe.. - 29 -

A.1 Fiches des différents colorants étudiés. - 29 -

Bibliographie.. - 49 -

 


1 Introduction

 

1.1 Présentation du laboratoire

 

Le Laboratoire de Spectrométrie Physique (SPECTRO) est une Unité Mixte de Recherche (UMR5588) associée à l’Université Joseph Fourier (UJF) et au Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Elle compte, en personnel permanent, 75 chercheurs ou enseignants chercheurs et 37 ingénieurs, techniciens administratifs. Elle accueille en outre 46 doctorants et 38 visiteurs ou stagiaires.

 

SPECTRO est un laboratoire de recherche fondamentale pluridisciplinaire dont les activités s’articulent autour de trois grandes thématiques : Physique du Solide et Nanophysique, Physique Moléculaire et Laser, Matière Molle et Biophysique. Elles revêtent de plus en plus un caractère pluridisciplinaire en se situant résolument à l'interface entre la physique et des disciplines voisines : environnement, astrophysique, chimie, sciences du vivant. Ces 3 thématiques sont portées par 11 équipes de recherche impliquant chercheurs et enseignants-chercheurs.

 

Parmi celles-ci, l'équipe Matériaux, Optique et Techniques Instrumentales pour le Vivant (MOTIV), créée en début 2005, est spécialisée dans l’optique physique et instrumentale appliquée aux sciences du vivant. Un premier thème repose sur l’absorption à 2 photons et la génération de second harmonique pour l’imagerie intravitale de la microvascularisation de la souris, avec le souci de rendre les images quantitatives vis-à-vis du volume capillaire et de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique. Une autre technique instrumentale développée est la microscopie à corrélation de fluorescence (FCS) ; les travaux portent sur des aspects méthodologiques et de modélisation concernant le photoblanchiment en milieu compartimenté, et également sur des aspects métrologiques, comme la corrélation croisée spatio-temporelle ; les applications sont tournées vers les biopuces et la biologie cellulaire. MOTIV a également une activité en ingénierie moléculaire, visant à exalter l’absorption à 2 photons par des couplages intermoléculaires dans les molécules dendritiques, à mettre au point des techniques de microfabrication 3D polymériques et métalliques, ainsi qu’à rechercher de nouveaux marqueurs fluorescents biphotoniques pour les sciences du vivant.


1.2 Analyse de la micro vascularisation cérébrale de la souris par microscopie non linéaire

 

A la différence de l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) et de la Tomographie par Emission de Positron (PET), les techniques optiques sont plus rarement applicables directement chez l'homme. Néanmoins, toute nouvelle thérapie ou nouveau médicament doit être, au préalable, mis au point chez l'animal, et dans ce domaine, de nouvelles techniques optiques, en cours de développement, offrent plusieurs avantages.

Pour être représentatif de l'état physiologique réel de l'animal en cours de radiothérapie, la microscopie intravitale doit être extrêmement peu invasive. Le succès de la méthode d'observation repose donc sur l’aptitude à obtenir de bonne images, à travers, ou à l’intérieur de tissus diffusants fortement la lumière, très rapidement et de façon extrêmement peu traumatisante. Une autre contrainte porte sur la grande méconnaissance des agents de contraste optiques (les colorant fluorescents excités à 2 photons) utilisés en conditions intravitales. En effet, alors qu'en biologie cellulaire les protocoles de coloration sont extrêmement bien documentés, il n'en est rien pour l'animal vivant. Pour rendre compatibles le "vivant" et les colorants, une étroite collaboration avec les chimistes est indispensable.

 

L’expérience de l’équipe MOTIV porte essentiellement sur l'imagerie de la vascularisation cérébrale de la souris nude saine et en cours de traitement radiothérapique par micro faisceaux X (technique MRT). Elle repose sur la mise au point d'une méthode d'observation par microscopie à 2 photons sur maintenant plus de 150 souris.

Une collaboration physicien-biologiste, démarrée en 2002, a permis de mettre en place un microscope à 2 photons et de lui apporter des modifications techniques, la microscopie intravitale imposant des contraintes techniques spécifiques. Elle a aussi permis de bien définir le "geste" de microchirurgie (petite craniotomie de 1 mm de diamètre en laissant intacte la dure mère) qui permet l'observation optique tout en restant minimalement invasive.

Concrètement, l’équipe MOTIV sait maintenant obtenir en routine d'excellentes images en 3 dimensions de la microvascularisation (et des tissus et cellules) du cortex cérébral de la souris vivante (résolution de 512 X 512 pixels dans le plan horizontal et jusqu'à 200 en profondeur). Ainsi c'est la quasi-totalité de l'épaisseur du cortex qui est accessible (environ 600 µm en dessous de la dure mère). Le temps d'acquisition est aussi remarquable puisque chaque image prend moins d'une seconde, une excellente image 3D peut donc être obtenue en une minute. On voit tout de suite l'énorme avantage de la microscopie optique à 2 photons à comparer avec l'IRM ou le PET, tant du point de vue résolution spatiale (maintenant à l'échelle cellulaire) que du point de vue temps d'acquisition, avantage accentué grâce à l'accès d'une large variété de colorants spécifiques de certaines fonctions biologiques. En fait, pour les expériences après irradiation, pour l'instant, la limitation principale vient uniquement du temps de déplacement de l’animal (environ 1 heure) entre le synchrotron et le laboratoire de spectrométrie physique.

 

Le protocole d'observation mis au point repose sur la coloration de la totalité du circuit sanguin (comme pour l'angiographie oculaire humaine) par injection intravasculaire dans la queue de la souris (technique minimalement invasive). Deux colorants, maintenant systématiquement utilisés simultanément, répondent à plusieurs contraintes :

- excitation simultanée des 2 colorants par transitions à 2 photons à 800 nm

- fluorescence spectralement bien séparable

- les propriétés vis à vis de la diffusion à travers la barrière hémato encéphalique (BHE) doivent être opposées pour les 2 colorants : un doit être diffusible et l'autre pas du tout.

- finalement la toxicité doit être faible.

C'est l'imagerie différentielle de ces deux colorants qui est originale : elle donne accès à la totalité du volume capillaire mais permet aussi de s'affranchir de cette contribution parfois éblouissante (via la différence) et de révéler les tissus et cellules adjacentes grâce au colorant qui à franchi la BHE (cf. Figure 1.1).

Figure 1.1 : Projection verticale d’une pile d’images acquises in vivo de 150 à  300 µm sous la dure mère (par pas de 2 µm) dans le cortex d’une souris Nude 48h après radiothérapie par microfaisceaux. Les quantités de colorants injectés sont: 100 µl d’une solution de 100 mg.ml-1 de FITC-Dextran et 50 µl ‘une solution de 5 mg.ml-1 de Sulforhodamine B. La coloration des capillaires en jaune provient de l'émission simultanée des 2 colorants alors que les "boules rouges" sont des corps cellulaires (vraisemblablement des astrocytes) qui ont capté le colorant diffusible uniquement lorsqu'ils ont subit l'irradiation X ( ici sous forme de surdosage en 3 bandes horizontales)

 

L’équipe MOTIV a aussi mis au point le traitement quantitatif de ces riches images. Il donne accès à des grandeurs aussi fondamentales que : le volume capillaire et son évolution en cours de traitement, la vitesse de diffusion des colorants suivant l'état de la BHE (conjugué avec les propriétés physico chimiques des colorants) et ceci avec une résolution spatiale exceptionnelle. Les procédures mises au point sont d'une telle efficacité qu'elles pourront être appliqués en temps réels lors de l'acquisition in vivo.

 

Toute cette expérience emmagasinée par l’équipe MOTIV permet de penser qu'il est maintenant possible de se rapprocher encore plus de la demande médicale.

En premier lieu il faut observer à très court terme les effets de l'irradiation (du rayonnement synchrotron) tout d'abord sur les tissus sains du cortex puis sur des tumeurs implantés. En effet l’existence d’une réaction à très court terme (de l’ordre de la minute) à une agression du cortex où interviennent des cellules "sentinelles" est maintenant connue. Cette réaction rapide a bien sûr d'importantes conséquences à long terme. Il est donc fondamental de tout mettre en oeuvre pour être à même de mesurer une réaction rapide à une "agression" radiothérapique en absence ou en présence de tumeurs. Le meilleur endroit pour réaliser ces expériences est certainement la ligne médicale de l'ESRF à cause de la haute qualité du faisceau X. L’équipe MOTIV propose donc d'y d'installer un poste de microscopie à 2 photons. La coloration la moins invasive, qui consistera à l'injection intravasculaire par la queue, sera donc évidemment choisie. Mais les problèmes liés à la vitesse de diffusion des colorants du fait de la BHE interviendront automatiquement. Dans ce domaine, tout reste à faire. Alors que la diffusion de drogues à but thérapeutique est maintenant bien documentée, il n'en est rien pour les colorants pour la microscopie du cortex.

 

 

C’est dans ce contexte qu’une étude systématique des colorants prometteurs vis à vis du passage de la BHE se révèle utile. Ainsi, le travail que j’ai effectué pendant mon stage consiste en une bonne mesure du coefficient de partage octanol/eau. En premier lieu, une méthode d’estimation assistée par ordinateur de ce coefficient sera utilisée. Puis une détermination expérimentale du coefficient de partage sera étudiée. Nous verrons enfin, en ouverture, que la vitesse de diffusion de colorant à travers une membrane polypeptidique pourra être mesurée par une méthode de luminescence à partir de vésicules électroformées.


2 Position du problème physique

 

2.1 Introduction du Coefficient de Partage

 

Le partage d’une molécule entre une phase aqueuse et une phase lipidique conditionne en partie ses propriétés biologiques telles que le transport, le passage à travers les membranes, la biodisponibilité (distribution et accumulation), l’affinité pour un récepteur et la fixation par une protéine, l’activité pharmacologique ou encore la toxicité. S’agissant de contaminants, ce même partage conditionne leur devenir dans notre environnement en particulier leur accumulation dans les organismes aquatiques.

 

Depuis les travaux de Collander à la fin des années 1950 [1], puis ceux du groupe de Hansch quelques années plus tard [2,3], le coefficient de partage K d’une molécule dans un système biphasique constitué de deux solvants non miscibles (le plus souvent le système octanol/eau), est reconnu pour sa faculté à mimer le passage de cette molécule à travers les membranes biologiques. Pour des solutions diluées, ce coefficient de partage octanol/eau est le rapport de la concentration d’une molécule de soluté dans l’octanol sur sa concentration dans l’eau lorsque le système biphasique est en équilibre :

 

 K = Coctanol/Ceau (1)

 

En fait, comme les valeurs de K mesurées s’étendent sur au moins douze unités de grandeur, on utilise de préférence les logarithmes décimaux. Le partage est donc une propriété physico-chimique importante qui peut être utilisée pour représenter la nature lipophile ou hydrophile d’une molécule. En effet, une molécule à valeur de K élevée sera très lipophile et diffusera donc beaucoup à travers la membrane. Inversement, une molécule à valeur de K faible sera très hydrophile et ne passera donc que très peu à travers la membrane. Quant au log K, il est très largement utilisé dans des études de relations structure-activité quantitatives (QSARs) dans les sciences pharmaceutiques, biochimiques, toxicologiques et dans les sciences de l’environnement.


2.2 La Barrière Hémato Encéphalique (BHE)

 

La barrière hémato encéphalique siège au niveau des capillaires cérébraux. Constituée d’une couche de cellules endothéliales solidement liées entre elles, elle empêche de nombreuses molécules de passer vers le cerveau (cf. Figure 2.1).

Il existe différents mécanismes de transport facilitant le passage des substances du sang vers le cerveau (cf. Figure 2.2). L’accès d’une substance au cerveau dépendra principalement de ses propriétés physico-chimiques et parmi celles-ci, la liposolubilité constitue un facteur essentiel. En effet, nous savons qu’une des caractéristiques de la BHE est l’absence de diffusion paracellulaire. Autrement dit, la diffusion libre d’une substance dépendra de sa capacité de diffusion dans la phase lipidique de la membrane plasmique (cf. Figure 2.3 et Figure 2.4) La diffusion libre d’une substance dépendra donc de son coefficient de partition octanol/eau. Les substances liposolubles diffuseront facilement alors que des substances peu liposolubles diffuseront très faiblement. On constatera qu’un coefficient de partition de 0,1 représente une valeur de transition au-delà de laquelle les molécules sont facilement extraites de la circulation.

 

           

Figure 2.1 : Représentation des composants de la BHE           Figure 2.2 : Différents types d’échanges à travers la BHE : A : Diffusion libre de petites molécules lipophiles; B : Arrêt des molécules hydrophiles ou de grande taille; C : Captage par transport actif; D : Expulsion par transport actif; E : Endocytose médiée par des récepteurs

           

 

Figure 2.3 : Membrane phospholipidique d’une cellule          Figure 2.4 : La membrane cellulaire est formée

endothéliale                                                                                       principalement de la bicouche lipidique (phospholipides) sur laquelle sont fixées les protéines


3 Travail effectué

 

3.1 Méthodes d’estimation des logK

 

Principe :

Pour estimer  les logK théoriques, la version d'évaluation du logiciel LogKow développé par l'organisation SRC (Syracuse Research Corporation) a été utilisée. On peut trouver cette version sur le site : www.syrres.com/eSc/est_kowdemo.htm.

Ce logiciel utilise la méthode de contribution atomes/fragments (AFC) [4,5,6] basée sur de multiples régressions linéaires de valeurs fiables et expérimentales de logK. Le calcul est découpé en deux étapes distinctes. La première étape consiste à décomposer  le composant  à étudier en atomes et fragments dont les logK sont connus et la deuxième étape consiste à introduire les facteurs de correction. Le logK du composant est alors facilement estimé en sommant toutes les valeurs des contributions des atomes et fragments avec les facteurs de correction apparaissant dans la structure chimique du composant. Pour exclure la possibilité de fragments manquants, un choix rigoureux a été fait dans les fragments et atomes simples pour qu’ils puissent être liés dans n’importe quelle combinaison.

 

Base de données :

Les valeurs fiables et expérimentales de valeurs de logK de plus de huit milles composants organiques ont été regroupées dans une base de données.

            Près de deux milles composés, ayant tous une structure chimique que l’on peut considérer comme « simple », ont été sélectionnés pour définir la valeur de logK de chaque fragment ainsi que leur facteurs de correction. Chaque valeur disponible, provenant d’une évaluation fiable, a été incluse dans la base de données. A la différence d'autres études, pour améliorer l'exactitude statistique, aucune valeur de logK n'a été exclue. Le reste des composés (à peu près six milles) a été utilisé pour valider ces valeurs.

En général, chaque atome qui n’est pas un hydrogène (comme le carbone, l’azote, l’oxygène, le sulfure,...) dans une structure est considéré comme un « noyau » pour le fragment. Le fragment exact est déterminé par ce qui est relié à cet atome. Plusieurs groupes fonctionnels sont traités de cette façon.

 

Introduction de facteurs de correction :

Nous verrons que, pour différents types de structures, les évaluations de logK obtenues à partir de la simple somme des contributions des atomes et des fragments sont, de manière significative, différentes des valeurs expérimentales. Ceci est habituellement expliqué par les effets d’interactions stériques entre groupements, l’attachement d’hydrogène ou encore les effets provenant de sous structures polaires. Par conséquent, des facteurs de correction ont été ajoutés à la méthode AFC. Le terme de facteurs de correction est bien approprié car leurs valeurs sont déduites de la différence entre la valeur du logK estimée et celle du logK mesurée.

 





Algorithme :

L’expression du logK suivant cette méthode peut ainsi s’exprimer comme suit :

 (2)

avec :

 : coefficient de partition de chaque atome ou fragment i

 : nombre d’apparition de l’atome ou du fragment i dans la structure

: facteur de correction j

 : nombre d’occurrence du facteur de correction j

 : constante linéaire d’équation

 

Mise en oeuvre :

A partir de la notation SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System) ou du CAS number (Chemical Abstract Service) d’un composé, ce logiciel propose de calculer le logK suivant la méthode AFC et de fournir, s'il existe dans leur base de données, un logK expérimental (Experimental logK).

Pour trouver le CAS number d'un colorant, nous avons utilisé le catalogue du fournisseur Invitrogen (www.invitrogen.com), le site de l'Institut National de Recherche et de Sécurité (www.inrs.com) et le manuel "Lambdachrome Laser Dyes" d'Ulrich Brackmann [7].

Dans le cas où le CAS number ne peut être obtenu directement, il faut passer par la notation SMILES. Pour définir la notation SMILES d'un composant, nous avons utilisé le module de dessin proposé par ChemSilico (www.logp.com) qui permet de trouver la notation SMILES à partir de la représentation 2D de la molécule.

            Après avoir rentré le CAS number ou le SMILES du composé, le logiciel renvoie un écran décrivant les étapes du calcul (cf. Figure 3.1).

 

KowWin (LogKow) Log K Calculation:

SMILES : O=C(OCC)c(ccc1)c(c1)C(c(cc(c2N(H)(H)(CL)CC)C)c(c2)O3)=C(C=C(C4=NCC)C)

         C3=C4

CHEM   : 2-[6-(Ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethyl-3H-xanthen-9-yl]benzoic

MOL FOR: C28 H31 CL1 N2 O3

MOL WT : 479.02

-------+-----+--------------------------------------------+----------+---------

 TYPE  | NUM |     LOGKOW v1.66 FRAGMENT DESCRIPTION      |  COEFF   |  VALUE 

-------+-----+--------------------------------------------+----------+---------

 Frag  |  5  |  -CH3    [aliphatic carbon]                | 0.5473   |  2.7365

 Frag  |  3  |  -CH2-   [aliphatic carbon]                | 0.4911   |  1.4733

 Frag  |  1  |  C     [aliphatic carbon - No H, not tert] | 0.9723   |  0.9723

 Frag  |  5  |  =CH- or =C<  [olefinc carbon]             | 0.3836   |  1.9180

 Frag  | 12  |  Aromatic Carbon                           | 0.2940   |  3.5280

 Frag  |  1  |  -O-   [oxygen, one aromatic attach]       |-0.4664   | -0.4664

 Frag  |  1  |  -C(=O)O  [ester, aromatic attach]         |-0.7121   | -0.7121

 Frag  |  1  |  Olefinic Carbon  [two aromatic attach]    |-0.4186   | -0.4186

 Frag  |  1  |  -N=C     [aliphatic attach]               |-0.0010   | -0.0010

 Frag  |  1  |  Halogen {-CL,-Br,-F,-I} [Nitrogen attach] | 0.0001   |  0.0001

 Frag  |  1  |  >N< [+5 valence; single bonds; H attach]  |-4.6000   | -4.6000

 Factor|  1  |  Fused aliphatic ring unit correction      |-0.3421   | -0.3421

 Factor|  1  |  >C=N-C [cyclic-type imine, ali carbon att]|-1.5500   | -1.5500

 Factor|  1  |  Reaction:  nitrogen[+5] / polar group     | 1.2500   |  1.2500

 Const |     |  Equation Constant                         |          |  0.2290

-------+-----+--------------------------------------------+----------+---------

                                                          Log Kow   =   4.0170

LogKow Estimated Log P:  4.02

 

 

Figure 3.1 : Ecran de calcul du logK de la Rhodamine 6G

 

Nous avons calculé les valeurs de différents colorants couramment utilisés (cf. Tableau 3.2).

 

Colorant

Log K estimated

Experimental Log K

POPOP

5.49

 

COUMARIN 4

1.58

1.9

Bis-MSB

8.15

 

COUMARIN 120

1.69

 

COUMARIN 2

2.73

 

COUMARIN 102

4.09

 

COUMARIN 152A

3.64

 

COUMARIN 152

2.65

 

COUMARIN 6H

3.54

 

COUMARIN 307

3.63

 

COUMARIN 314

3.63

 

COUMARIN 30

4.23

 

COUMARIN 334

2.82

 

COUMARIN 7

3.68

 

BRILLANTSULFAFLAVIN

-2.61

 

COUMARIN 153

4.51

 

URANIN

-0.67

 

FLUORESCEIN 27

4.64

 

RHODAMINE 110

2.84

 

RHODAMINE 6G

4.02

 

RHODAMINE B

1.85

1.95

SULFORHODAMINE B

-2.15

 

DCM

4.79

 

CRESYL VIOLET

3.73

 

PHENOXAZON 9

4.38

 

NILE BLUE

-0.62

 

OXAZINE 170

5.41

 

OXAZINE 1

5.13

 

HIDCI

3.23

 

CRYPTOCYANINE

2.7

 

DDI

3.47

 

HITCI

4

 

IR 125

0.72

 

DTTCI

3.34

 

HOECHST 33258

-1.68

 

HOECHST 33342

4.34

 

IODURE DE PROPIDIUM

-0.26

 

BROMURE D'ETHIDIUM

-0.38

 

 

Tableau 3.2 : Valeurs de logK déterminées par le logiciel


3.2 Détermination expérimentale des log K

 

Chaque fois que cela sera possible, le log K d’une molécule fera l’objet d’une détermination expérimentale. La méthode dite des flacons agités ou « shake-flask », qui sera utilisée dans notre étude, est la plus ancienne. Elle reste cependant la méthode de choix pour des molécules organiques originales et de ce fait, elle est préconisée comme procédure standard de caractérisation par l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) [8].

 

Préparation :

L’expérience doit être effectuée à température, pression et pH constants. En raison des équilibres multiples impliqués, cette méthode d'essai ne peut pas être appliquée aux composés ionisables sans appliquer une correction. C’est pour cela que l’on utilise une solution tampon de PBS (Phosphate Buffer Saline : solution saline à pH physiologique) en lieu et place de l’eau.

Les colorants étudiés, qui se présentent sous forme de poudre, sont dans un premier temps placés dans un tube à essai dans lequel on ajoute du PBS. On agite ensuite le tube pour assurer une bonne dissolution du colorant dans le PBS. Puis l’octanol est introduit dans le tube et le système biphasique est agité à l’aide d’un agitateur électrique pendant plusieurs minutes. L’expérience a montré que 5 minutes d’agitation sont suffisantes pour établir l’équilibre de partage.

Ensuite, il faut observer un temps de décantation d’au moins 24 heures pour que les phases se séparent.

Une fois que le système biphasique est à l’équilibre (cf. Figure 3.3), on va prélever une petite quantité de chaque phase.

 

 

 

 

 

       Phase

       Octanol

 

 

 

       Phase

       PBS

 

 

 

 

Figure 3.3 : Système biphasique de Rhodamine 6G à l’équilibre.

Nb : Toutes les images présentée dans suite, ne sont pas inversée : la phase octanol, la moins dense surnage.

 

 

 

Le prélèvement de la phase octanol, qui se trouve au dessus de la phase PBS, ne demande pas de précaution particulière. Par contre, la phase aqueuse doit être prélevée par un procédé qui réduit au minimum le risque d'inclure des traces d’octanol. Ainsi, on utilisera une pipette jetable que l’on remplit partiellement d'air. L'air est doucement expulsé tout en insérant l'aiguille dans la couche d’octanol. Une fois arrivé dans la phase aqueuse, un volume de PBS est alors aspiré dans la pipette. La pipette est rapidement enlevée de la solution. Le contenu de la pipette peut alors être employé comme échantillon aqueux.

Lorsque cela sera nécessaire, l’échantillon de phase octanol ou PBS pourra être dilué jusqu’à 100000 fois. L’alcool, dont l’absorption est sensiblement la même que le PBS et l’octanol, sera utilisé pour les dilutions.

Ensuite, les prélèvements de chaque phase sont introduits dans des cuves.

 

La concentration dans les deux phases séparées est alors déterminée par spectrophotométrie.


3.3 La Spectrophotométrie UV-VIS (*)

 

La Spectrophotométrie d’absorption moléculaire dans le domaine ultraviolet (UV), de 185 à 380 nm environ, et visible (VIS), de 380 à 800 nm environ, est une technique d'analyse physico-chimique qui repose sur l'absorption de la lumière par les espèces chimiques colorées et qui permet de déterminer plus quantitativement que qualitativement des ions ou des molécules présents dans une solution, sans la modifier ou l'altérer. Cette technique utilise la propriété de ces ions ou molécules de pouvoir passer de l'état fondamental à un état excité par absorption d'un rayonnement de longueur d'onde adéquate. Une solution est ainsi colorée si elle absorbe une partie des radiations de la lumière blanche. La couleur alors perçue par l'oeil (domaine du "visible") résulte de la superposition des couleurs des radiations non absorbées.

Cette méthode d'analyse est intéressante car elle permet de travailler sur de faibles quantités de substances et est non destructrice vis-à-vis de l'échantillon.

 

Transitions électroniques :

Un électron à l’état fondamental absorbe des radiations d’une énergie E suffisante pour l’élever à un niveau d’énergie supérieur, l’état excité, ce qui détermine la longueur d’onde l par la relation :

 (3)

avec :

h : la constante de Planck

c : la vitesse de la lumière

 

Le retour au plus bas niveau d’énergie, l’état fondamental, se produit par perte d’énergie sous forme de chaleur ou par rémission de radiation (fluorescence ou phosphorescence).

S’il n’y avait qu’un seul type de transition (cf. Figure 3.4), le spectre d’absorption UV-VIS  n’aurait qu’une seule raie à la longueur d’onde correspondant à l’énergie nécessaire à la transition (cf. Figure 3.5). Dans ce cas idéal, la spectrophotométrie UV-VIS serait un outil immédiat d’analyse qualitative, la longueur d’onde exacte d’absorption serait parfaitement caractéristique de la molécule.

 

Vibrations et rotations :

Cependant, de nombreux autres niveaux d’énergie (dus à des vibrations, des rotations et des transitions moléculaires) se superposent aux niveaux d’énergie électroniques, et plusieurs transitions sont possibles (cf. Figure 3.6).

Le spectre résultant prend alors la forme d’une bande large sans caractéristique très marquée (cf. Figure 3.7).

 

 

 

 

 

 

 

(*) UV Spectrometry Group UV Spectroscopy: Techniques, Instrumentation, Data Handing, 4

Figure 3.4                                                                                                                Figure 3.5

 

 

Figure 3.6                                                                                                                Figure 3.7

 

 

En effet, comme les différences de niveaux d’énergie associés aux vibrations et aux rotations sont bien plus petites que celles mises en jeu dans les transitions électroniques, l’excitation surviendra à des plus grandes longueurs d’onde correspondantes.

Ainsi, les transitions liées aux rotations nécessitent seulement des micro-ondes (très grandes longueurs d’onde), tandis que celles liées aux vibrations sont associées aux régions infrarouges.

Les transitions de vibration sont souvent accompagnées par la «structure fine rotationnelle», c’est-à-dire des transitions de rotation entre les niveaux de vibration : les pics ne sont pas aussi fins que dans le cas de la rotation seule.

De même, dans l’UV-VIS, les transitions électroniques sont accompagnées par des transitions de vibration entre les niveaux électroniques (c’est la «structure fine vibrationnelle»).

Ainsi, les pics ont l’apparence de bandes (cf. Figure 3.8).

 

 

Figure 3.8

 

Il en résulte que la spectrophotométrie UV-VIS donne relativement peu d’informations qualitatives.

D’autres facteurs tels que l’environnement chimique de l’échantillon (par exemple le solvant) peuvent aussi affecter la position et la forme de la bande d’absorption.

 

Absorption spécifique :

Toutefois, puisque chaque électron dans une molécule a un unique état d’énergie fondamental et des niveaux excités bien spécifiques, les transitions possibles pour les électrons dans une molécule donnée sont prévisibles et en nombre fini. Chacune des transitions, ou saut d’énergie, nécessite l’absorption d’un quantum d’énergie. On constate donc une absorption spécifique et, par un ensemble de points d’absorbance en fonction de la longueur d’onde, on obtient le spectre d’absorption de la molécule.

Ce spectre permet à la fois l’identification (analyse qualitative), mais dans certaines limites seulement, et, plus précisément, l’estimation (analyse quantitative) d’un composé.

 

Analyse quantitative :

L’analyse quantitative par la spectrophotométrie UV-VIS est très utilisée car l’absorption est plus ou moins importante selon le nombre de groupements d’atomes placés sur le trajet de la lumière : des lois connues relient cette absorption à ce nombre dans certaines conditions opératoires.

La loi de Bouguer-Lambert exprime la variation de l'intensité lumineuse en fonction de la distance parcourue dans un milieu homogène. Lorsqu'une lumière monochromatique d'intensité I0 traverse un milieu homogène,  l'intensité de la lumière émergente I décroît exponentiellement lorsque l'épaisseur l du milieu absorbant augmente :

 (4)

a est une constante appelée coefficient d'absorption, caractéristique du milieu et de la longueur d'onde considérés.

 

Dans le cas des solutions, selon la loi de Beer, l’absorption de la lumière est directement proportionnelle à la fois à la concentration du milieu absorbant et à l’épaisseur de la cuve où se trouve le milieu. On fait donc intervenir les concentrations :

 (5)

 est un coefficient caractéristique de la substance appelé coefficient d'absorbance molaire (L.mol-1.cm-1), l est l'épaisseur de la cuve (cm) et c la concentration de la solution (mol/L).

Cette loi est vérifiée lorsque la solution est de concentration inférieure à : c < 0,1 mol.L-1. De plus, il est important de noter que  est une fonction de la longueur d’onde et donc que la loi de Beer-Lambert est seulement vraie en lumière monochromatique.

 

La relation fondamentale utilisée en spectrophotométrie est présentée sous la forme :

 (6)

A est l'absorbance ou densité optique (sans unité).

On remarque que plus  est grand, plus la solution absorbe.

 

 

Figure 3.10 : Relation entre absorbance et concentration

 

La relation entre absorbance et concentration étant linéaire (cf. Figure 3.10), cette relation peut être utilisée pour réaliser des dosages ou des suivis cinétiques. De plus, cette simple relation linéaire entre l’absorbance et la concentration et la facilité relative de mesure de la lumière UV-VIS vont nous permettre de mesurer aisément le coefficient de partage des colorants étudiés. En effet, on a vu précédemment (cf. 2.1) que ce coefficient de partage est donné par la relation (1) :

K = Coctanol/Ceau

Or d’après la relation (6) :

 (7)

 

Donc :

K = Coctanol/Ceau = (Aoctanol/log10(e).a.l)/(Aeau/log10(e).a.l) = Aoctanol/Aeau

Le coefficient de partage peut donc s’exprimer comme le rapport des densités optiques de la phase octanol et de la phase eau.

K = Aoctanol/Aeau (8)

De plus, dans notre étude, à cause d’un mauvais fonctionnement du spectromètre utilisé, nous  ne sommes pas en mesure de mesurer des densités optiques de plus de 1.5. Nous calculerons donc nos concentrations de telle sorte que :

 (9)

soit :

 (10)

or les cuves que nous utiliserons pour effectuer nos spectrométries ont une épaisseur de 1cm, donc :

  (11)

 

Nous allons travailler dans le visible, nous allons donc sélectionner des longueurs d’ondes allant de 450nm à 600nm. En outre, les solutions colorées présentent une longueur d’onde lumineuse où l’absorption est maximale. Cette longueur d’onde maximale lmax ne dépend pas de la concentration, c’est une grandeur caractéristique de l’ion absorbant. Elle est utilisée pour effectuer les mesures photométriques sur des solutions de différentes concentrations.

 

Matériel :

Le spectrophotomètre utilisé dans notre étude mesure directement l'absorbance A d'une solution colorée contenue dans une cuve.

Il est constitué (cf. Figure 3.10):

- d'une source lumineuse polychromatique (lumière blanche émise par une lampe à filament de tungstène)

-  d'un monochromateur permettant de sélectionner une longueur d'onde à partir de la lumière blanche. Il est formé d'un réseau qui disperse la lumière blanche. La sélection se fait à l'aide d'une fente

- d'une cuve contenant un échantillon de solution de l'espèce colorée que l'on étudie

- d'une cellule photoélectrique qui fournit un courant électrique proportionnel au nombre de photons qu'elle reçoit

- d'un détecteur électronique dont la réponse est proportionnelle à ce courant électrique et permet une mesure relative de l'intensité lumineuse.

- d’un système de lecture qui la donne en absorbance A :

 (12)

Figure 3.10 : Schéma de montage

 

Le monochromateur est composé d’une fente d’entrée, d’un dispositif de dispersion et d’une fente de sortie.

La cuve est placée à la sortie du monochromateur, et non pas juste après la source, afin d’éviter de détériorer des molécules fragiles avec tout le rayonnement UV de la source et de provoquer des fluorescences.

La lumière polychromatique de la source est focalisée sur la fente d’entrée du monochromateur qui transmet sélectivement une bande étroite de lumière. Cette lumière, à certaines longueurs d’onde, traverse l’échantillon, et agit sur les molécules de la solution selon les principes énoncés précédemment (excitation des électrons puis rémission de lumière), avant d’atteindre la cellule photoélectrique.

 

Manipulation :

            Il faut connaître l’absorption des solvants dans lesquels se trouve le colorant. Ainsi, l’analyse d’un colorant nécessite la préparation de 4 cuves :

-         une cuve de référence contenant de l’octanol

-         une cuve contenant un échantillon de la phase octanol

-         une cuve de référence contenant du PBS

-         une cuve contenant un échantillon de la phase PBS

Les cuves de référence permettent de mesurer la « Baseline » de l’Octanol et du PBS. On mesure l’absorption de l’octanol pur puis celle de l’échantillon de la phase octanol. On de la même façon pour le PBS pur et l’échantillon de la phase PBS.

On obtient ainsi deux spectres (cf. Figure 3.11 et Figure 3.12).

Les différents spectres que nous avons obtenus sont regroupés dans l’annexe : A.1 Fiches des différents colorants étudiés.

 

Figure 3.11 : Spectre d’absorption de la Rhodamine 6G en phase Octanol diluée 10000 fois

 

Figure 3.12 : Spectre d’absorption de la Rhodamine 6G en phase PBS

 

On peut voir que, dans cette exemple, le pic d’absorption dans la phase octanol à 521.429nm est de 0.250 et que le pic d’absorption dans la phase PBS à 529.894nm est de 0.156.

 On note que les pics ne sont pas exactement à la même longueur d’onde dans la phase octanol et la phase eau. Ce phénomène est connu et porte le nom de solvatochromisme. Il provient de l’interaction électronique entre les molécules de solvant et de colorant qui perturbe (faiblement) les fonctions d’onde des colorants induisant une petite variation de niveau d’énergie. Ce phénomène a heureusement une très faible influence sur les probabilités de transition. On peut toujours considérer que PBS = octanol .

 

 

Comme on l’a vu précédemment, le coefficient de partage est directement donné par la relation (8) :

 

K = Aoctanol/Aeau

 

Or on a dilué 10000 fois la phase octanol, donc :

 

KRh6G = (0.250*10000)/0.156 = 16025

 

Soit log KRh6G = 4.2

 

            Nous avons procédé de la même façon pour effectuer les calculs des différents logK expérimentaux (cf. Tableau 3.13).

 

On remarque que, pour la Rhodamine 6G, le logK expérimental est identique au logK théorique. Le Tableau 3.13 montre que ce n’est pas toujours le cas. Nous allons voir que différents phénomènes peuvent expliquer cette déviance.

 

 

Colorants

LogK théorique

LogK expérimental

Rhodamine 6G

4.2

4.2

Sulforhodamine G

-1.98

-2.8

Rhodamine B

1.85

1.77

Sulforhodamine B

-2.15

-1.44

Fluorescein Sodium

-0.67

-0.89

Iodure de Propidium

-0.26

-1.91

Hoechst 33342

4.34

-2.44

 

Tableau 3.13 : Valeurs que nous avons mesurées par la méthode « shake flask » comparées aux valeurs données par le logiciel

 

 

Par ailleurs, nous sommes déjà en mesure d’expliquer les fortes différences de valeur de logK entre les rhodamines et les sulforhodamines. Prenons l’exemple de la Rhodamine 6G et de la Sulforhodamine G. Leurs formules éclatées sont sensiblement les mêmes (cf. Figure 3.14 et Figure 3.15). La seule différence est la présence d’une chaîne alkyle dans la Rhodamine G substituée par deux groupements sulfonates (SO3-) dans la Sulforhodamine G. Ce groupement sulfonate est connu pour avoir des propriétés fortement hydrophiles. La Sulforhodamine G sera donc plus « à l’aise » dans la phase PBS et donc en concentration plus importante dans cette phase que dans la phase octanol. Par contre, la chaîne alkyle est connue pour être lipophile. La Rhodamine 6G aura donc plus d’affinité avec la phase octanol et sa concentration dans cette phase sera plus importante que sa concentration dans la phase PBS. Cela explique que le coefficient de partage de la Sulforhodamine G soit plus faible que celui de la Rhodamine 6G.

 

Structure: 3KB            Structure: 3KB

Figure 3.14 : Formule de la Rhodamine 6G                                               Figure 3.15 : Formule de la Sulforhodamine G

 

 

Ces fortes différences de valeur de coefficient de partage peuvent avoir un fort intérêt. En effet, dans le contrôle de la viabilité cellulaire [9], on utilisera un colorant fortement perméant (avec un coefficient de partage élevé) et un deuxième faiblement perméant (avec un coefficient de partage faible). De ce fait, lorsque la cellule commencera à se détruire, sa membrane deviendra de plus en plus perméable et laissera petit à petit le deuxième colorant pénétrer.


4 Discussion

 

4.1 Observations et remarques

 

La détermination des logK par le programme informatique est rapide, pour autant, le programme semble avoir ses limites. Le principal problème rencontré est la tautomérie, transformation d'un groupement fonctionnel en un autre par déplacement concomitant d'un atome d'hydrogène et d'une liaison π (exemple : liaison double). Ainsi, deux tautomères possédant la même formule chimique mais pouvant être représentés dans deux formes différentes, leurs valeurs estimées de logK peuvent être nettement différentes et varier de plusieurs unités de log. Il est donc difficile de savoir à l’avance si l’on considère le bon tautomère.

De plus, les propriétés moléculaires ne sont pas intégrées au calcul. En effet, pour le coefficient de partage de composés de « grande » taille (composés de longue chaîne hydrophobes par exemple), le programme trouve un logK théorique différent de celui trouvé expérimentalement (cf. Tableau 3.13). Nous avons pensé que ceci pouvait s’expliquer par la formation de micelles (cf. 4.2), agrégats sphéroïdaux de molécules possédant une tête polaire hydrophile dirigée vers le solvant et une chaîne hydrophobe dirigée vers l'intérieur. C'est l'hydrophobie des chaînes qui entraîne ce regroupement des molécules et la mise en place de structures sphériques visant à éliminer le solvant. Ces agglomérats ainsi formés n’ont pas les mêmes propriétés lipophiliques (et hydrophiliques) que les molécules isolées. Ils peuvent donc perturber la bonne solubilité du colorant et modifier la concentration du composé dans les solvants. Ce phénomène peut expliquer la différence entre les logK théorique et expérimental.

En outre, il peut être intéressant de remarquer qu’une propriété moléculaire aussi complexe que la lipophilie est calculée principalement sur la base de valeurs de fragments ou d’atomes déterminées de façon empirique et en faisant abstraction des processus impliqués dans le phénomène de solvatation et des propriétés moléculaires qui les affectent. D’ailleurs, nous avons rencontré un certain nombre de difficultés à dissoudre les Rhodamines 700 et 800 dans le PBS et nous n’avons pas été en mesure de calculer expérimentalement leur coefficient de partage. Cela a mis en évidence que les propriétés fondamentales de certaines molécules telles que leur miscibilité avec le PBS entraînent des difficultés à établir le comportement plus ou moins lipophile de certaines molécules. Cet exemple montre que la méthode « shake flask » a aussi ses limites.

En effet, cette méthode expérimentale de détermination de log K souffre de plusieurs inconvénients. Tout d’abord leur domaine d’application est relativement étroit (domaine de mesure étroit de l’ordre de –2 à +4). Ensuite la durée d’étude est longue (temps de repos de 24h). De plus, dans le cas des colorants sulfatés, nous avons été confronté à la formation d’émulsions lors de l’agitation. D’autre part, du fait de la nature intrinsèque de certaines molécules, on remarque que leurs log K sont inaccessibles à l’expérience. C’est le cas en particulier des surfactants qui ont tendance à s’accumuler à l’interface du système biphasique au lieu de se disperser dans les deux phases (cf. 4.2 et Figure 4.1).

 

 

sulfog1

 

 

 

Figure 4.1 : "Dépôts" entre les 2 phase observés dans le cas de la Sulforhodamine G

 

Malgré ses imperfections, elle reste cependant la méthode de choix pour des molécules organiques originales. La méthode « shake flask » est recommandée lorsque la valeur de logK est comprise entre –2 et +4. Elle ne s’applique qu’aux substances pratiquement pures, solubles dans l’eau et l’octanol.

 

Nous avons mis en évidence que la vitesse de passage de la BHE peut être influencée en agissant sur le caractère lipophile/hydrophile via la modulation de la longueur de bras alkyles ou de fonctions polaires (groupements sulfonate type -SO3-).

 

Quand à lui, le logiciel semble être un bon outil pour prédire le coefficient de partition de composés simples et de tailles « raisonnables », inférieures à 18 atomes de carbone, mais il est évident que le calcul expérimental reste le plus fiable.

 


4.2 Les Tensioactifs

 

Nous nous intéressons dans cette partie aux tensioactifs car nous pensons que les Sulforhodamines, dont la structure présente une tête polaire (groupement sulfonate) et une queue grasse (groupement alkyle), peuvent avoir une fonction tensioactive. Ceci pourrait expliquer la différence entre les valeurs théorique et expérimentale de logK.

 

Les tensioactifs ou agents de surface sont des molécules d’origine naturelle ou synthétique qui modifient la tension superficielle entre deux surfaces. On parle aussi de surfactif, transposition du mot anglais surfactant qui est la compression de « surface active agent » (agent de surface actif). Les composés tensioactifs sont des molécules amphiphiles, c'est-à-dire qu'elles possèdent une double affinité, que l'on définit du point de vue physico-chimique comme une dualité polaire-apolaire.

Elles présentent d'une part un groupe apolaire ou peu polaire, à caractère hydrophobe/lipophile, qui est en général un groupe hydrocarboné de type alkyle ou alkylbenzène, et qui peut contenir éventuellement des atomes d'halogène et même des atomes d'oxygène (queue hydrophobe) et d'autre part un groupement polaire, à caractère hydrophile, qui contient des hétéro-atomes comme O, S, P, ou N, qui se trouvent dans des groupes alcool, thiol, acide, sulfate, sulfonate, phosphate, amine, amide…(tête polaire) comme illustré sur la Figure 4.1

 

 

Figure 4.1 : Schéma simplifié d'un tensioactif

 

Il existe quatre grandes classes de tensioactifs : les anioniques, les non-ioniques, les

cationiques et les amphotères. Quel que soit le groupement hydrophile de la molécule, la

queue hydrophobe est constituée par une chaîne alkyle dite chaîne grasse. Si la tête polaire

liée de façon covalente à la queue hydrophobe du tensioactif porte une charge négative

(-COO-, -SO3-, -SO4-, etc.), le tensioactif est dit anionique. Les savons, les alkylbenzènes

sulphonates, les sulfates d'alcool gras, sont anioniques. Si la tête polaire porte une charge

positive, l’agent de surface est cationique. Les sels d’ammonium quaternaire constituent un

exemple de cette catégorie. Les tensioactifs non ioniques sont constitués d’une tête polaire

non ionisable en solution aqueuse.

 

La structure amphiphile détermine les propriétés des tensioactifs. Ils présentent

principalement des pouvoirs mouillant, solubilisant, détergent et émulsifiant.

Nous nous intéressons ici aux pouvoirs des tensioactifs de se regrouper en micelles et à la notion d'émulsification.

Les tensioactifs peuvent former des micelles  comme illustré sur la Figure 4.2. La formation de ces micelles n'intervient qu'à partir d'une certaine concentration en tensioactifs, elle est appelée concentration micellaire critique ou CMC.

 

Figure 4.2 : Micelle

Un émulsifiant permet de mélanger deux liquides non miscibles, dans notre cas l’octanol et le PBS. L’octanol est dispersé dans le PBS sous forme de petites gouttelettes. L’émulsion intervient à l'échelle microscopique, ce phénomène d’émulsification est illustré sur la Figure 4.3.

Le pouvoir émulsionnant est étroitement lié à la polarité de la molécule. Cette polarité est définie par la balance hydrophile/lipophile (HLB) dont les valeurs représentent une échelle arbitraire. Un

composé faiblement hydrophile a une HLB faible et inversement.

 


Figure 4.3 : Dispersion de deux phases liquides non miscibles : principe de l’émulsion

 

Ces propriétés sont influencées par plusieurs facteurs, d'une part la nature des molécules,

d’autre part la formulation globale dans laquelle se trouve le tensioactif, et enfin la

température.

Les propriétés physiques sont liées à la constitution chimique des composés tensioactifs. La longueur de la chaîne lipophile et la nature du groupement hydrophile sont des facteurs très importants. La symétrie de la molécule dépendant de la longueur de la queue hydrophobe et pouvant être modifiée par ramification, a également une influence.

Il est généralement admis que les chaînes longues, de 18 à 22 atomes de carbone, confèrent à la molécule des pouvoirs émulsionnants.


5 Ouverture

 

5.1 Observation de la diffusion des colorants à travers la membrane de vésicules

 

On se propose d’observer la vitesse de diffusion d’un colorant à travers la membrane d’une vésicule.

Pour cela  on va créer des vésicules par électroformation. Pour avoir une pression osmotique identique à l’intérieur comme à l’extérieur de la vésicule, on prépare :

-         10mL de Sucrose (342g.mol-1) à 50mmol.L-1 :

on dilue 0,171g de Sucrose dans 10mL d’eau désionisée

-         10mL de Glucose (180g.mol-1) à 70mmol.L-1 :

on dilue 0,126g de Glucose dans 10mL d’eau désionisée

            En effet, une trop forte pression osmotique du milieu extérieur pourrait entraîner une compression des vésicules et leur contraction, et inversement, une pression osmotique trop forte à l’intérieur des vésicules pourrait entraîner une rupture de la membrane et l’explosion des vésicules.

De plus, comme on veut que nos vésicules reposent sur le fond de la cuve, on utilise le Sucrose en solution interne car il est plus « lourd » que le Glucose.

 

Une fois les vésicules formées, on peut imaginer de les laisser suffisamment longtemps dans une solution de Sucrose colorée. Ainsi, le colorant va lentement pénétrer dans les vésicules. Ensuite, il suffit de diluer une petite quantité de cette solution de Sucrose contenant des vésicules « colorées » dans une grande quantité de solution de Glucose.

 

On espère obtenir des vésicules de 100 microns de diamètre et, grâce aux 8 bits de résolution des microscopes, on peut espérer une densité optique de 2. Donc la concentration de colorant (ici la Sulforhodamine B) dans la vésicule sera telle que :

A.N. : 

            Nous nous proposons d’observer la perméabilité de la membrane par luminescence, les premiers essais semblent assez encourageants (cf. Image 5.1). L’intensité lumineuse étant proportionnelle à la concentration en colorant, nous pourrons calculer la perméabilité à l’aide de la loi de Fick :

avec :

Ci : concentration de colorant à l’intérieur de la vésicule

Ce : concentration de colorant à l’extérieur de la vésicule

S : surface d’échange

V : volume de la vésicule

P : perméabilité

Pour le moment, le principal problème rencontré est le mouvement de roulement des vésicules sur le fond de la cuve d’observation (chambre Labtech monopuit-Nunc) ce qui rend très difficile l’analyse par luminescence. Il faut donc encore mettre au point cette technique pour qu’elle soit réellement utilisable.

 

 

 

Image 5.1 : Vésicule remplie de Sulforhodamine B et profile RGB


Annexe

 

A.1 Fiches des différents colorants étudiés

 

A.1.1 Rhodamine B.............................................................................................................- 30 -

 

A.1.2 Sulforhodamine B.....................................................................................................- 32 -

 

A.1.3 Rhodamine 6G..........................................................................................................- 37 -

 

A.1.4 Sulforhodamine G....................................................................................................- 39 -

 

A.1.5 Sulforhodamine 101..................................................................................................- 41 -

 

A.1.6 Hoechst 33342...........................................................................................................- 43 -

 

A.1.7 Iodure de Propidium................................................................................................- 45 -

 

A.1.8 Fluorescein Sodium..................................................................................................- 47 -


A.1.1 Rhodamine B

 

Formule : C28H31ClN2O3

Masse Molaire : 479.02

CAS Number : 81-88-9

 

 

Rhodamine B en phase Octanol diluée 100 fois

 

 

 

 

 

Rhodamine B dans la phase PBS

 


A.1.2 Sulforhodamine B

 

Formule : C27H30N2O7S2

Masse Molaire : 558.66

CAS Number : 2609-88-3

 

Structure: 3KB

 


Sulforhodamine B en phase Octanol

 

 

 

 

 

Sulforhodamine B en phase PBS diluée 100 fois

 


Sulforhodamine B en phase Octanol diluée 10 fois

 

 

 

 

 

Sulforhodamine B en phase PBS diluée 100 fois

 


Sulforhodamine B en phase Octanol diluée 10 fois

 

 

 

 

 

Sulforhodamine B en phase PBS diluée 100 fois

 


Sulforhodamine B en phase Octanol diluée 10 fois

 

 

 

 

 

Sulforhodamine B en phase PBS diluée 100 fois

 


A.1.3 Rhodamine 6G

 

Formule : C28H31ClN2O3

Masse Molaire : 479.02

CAS Number : 989-38-8

 

Structure: 3KB

 


Rhodamine 6G en phase Octanol diluée 10000 fois

 

 

 

 

 

Rhodamine 6G en phase PBS

 

 

A.1.4 Sulforhodamine G

 

Formule : C25H25N2NaO7S2

Masse Molaire : 552.59

CAS Number : 5873-16-5

 

 

Structure: 3KB

 

                                              
Sulforhodamine G en phase Octanol

 

 

 

 

Sulforhodamine G en phase eau désionisée diluée 200 fois

 

 

A.1.5 Sulforhodamine 101

 

Formule : C31H30N2O7S2

Masse Molaire : 606.71

 

 

 


Sulforhodamine 101 en phase Octanol diluée 100 fois

 

 

 

 

 

Sulforhodamine 101 en phase PBS diluée 100 fois

 

 

A.1.6 Hoechst 33342

 

Formule : C27H37Cl3N6O4

Masse Molaire : 615.99

CAS Number : 23491-52-3

 

Structure: 3KB

 


Hoechst 33342 en phase Octanol

 

 

 

 

 

Hoechst en phase Sérum Physiologique diluée 50 fois

 

 

A.1.7 Iodure de Propidium

 

Formule : C27H34I2N4

Masse Molaire : 668.40

CAS Number : 25535-16-4

 

Structure: 3KB

 


Iodure de Propidium en phase Octanol

 

 

 

 

 

Iodure de Propidium en phase PBS diluée 100 fois

 

 

A.1.8 Fluorescein Sodium

 

Formule : C20H10O5Na2

Masse Molaire : 376.28

CAS Number : 518-47-8

 

 

 

 


Fluorescein Sodium en phase Octanol

 

 

 

 

 

Fluorescein Sodium en phase PBS

 

Bibliographie

 

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