Microscopies intravitales en optique non linéaire

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Forum d'innovation technologique 

les NOUVELLES TECHNOLOGIES pour la SANTE 

30-31 Octobre 2007, Campus Santé de Grenoble


Mieux voir dans la tête des souris   video_cortex
Nous cherchons à surpasser les inconvénients de la vidéomicroscopie classique .
En  utilisant l'optique non linéaire en microscopie à balayage : la microscopie biphotonique  et la microscopie par génération de second harmonique.

A la différence de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et de la Tomographie par émission de positron (PET), les techniques optiques sont plus rarement applicables directement chez l'homme. Néanmoins, toute nouvelle thérapie ou nouveau médicament doit être, au préalable, mis au point chez l'animal, et dans ce domaine, de nouvelles techniques optiques, en cours de développement, offrent plusieurs avantages.
Pour être représentatif de l'état physiologique réel de l'animal en cours de radiothérapie, la microscopie intravitale doit être extrêmement peu invasive. Le succès de la méthode d'observation repose donc sur notre aptitude à obtenir de bonne images, à travers, ou à l’intérieur de tissus diffusants fortement la lumière, très rapidement et de façon extrêmement peu traumatisante. Une autre contrainte porte sur la grande méconnaissance des agents de contraste optiques (les colorant fluorescents excités à 2 photons) utilisés en conditions intravitales. En effet, alors qu'en biologie cellulaire les protocoles de coloration sont extrêmement bien documentés, il n'en est rien pour l'animal vivant. Il nous faut même bien souvent mettre à contribution les chimistes pour rendre compatibles le "vivant" et les colorants. Ceci explique notre association avec des chimistes du laboratoire.

1) Ce que nous savons maintenant faire :

Notre expérience porte essentiellement sur l'imagerie de la vascularisation cérébrale de la souris nude saine et en cours de traitement radiothérapique par micro faisceaux X (technique MRT). Elle repose sur la mise au point d'une méthode d'observation par microscopie à 2 photons sur maintenant plus de 150 souris. Cette action qui a démarré en 2002 a déjà prouvé qu'un collaboration physicien-biologiste bien équilibrée était payante et formatrice (Deux thèses en cours dont une codirigée physicien-biologiste). Elle a été soutenue par nos laboratoires (Laboratoire de spectrométrie physique et unité INSERM U594) et les collectivités régionales (CPER nouvelles méthodes physiques pour les sciences du vivant). Elle nous a permis de mettre en place un microscope à 2 photons et de lui apporter des modifications techniques puisque la microscopie intravitale impose des contraintes techniques spécifiques. Elle a aussi permis de bien définir le "geste" de microchirurgie (petite craniotomie de 1 mm de diamètre en laissant intacte la dure mère) qui permet l'observation optique tout en restant minimalement invasive.
Concrètement : nous savons maintenant obtenir en routine d'excellentes images en 3 dimensions de la microvascularisation (et des tissus et cellules )du cortex cérébral de la souris vivante. le voxel est environ de 1µm3 et les images ont une résolution de 512 X 512 pixels dans le plan horizontal et jusqu'à 200 en profondeur. Ainsi c'est la quasi-totalité de l'épaisseur du cortex qui est accessible (environ 600 µm en dessous de la dure mère). Le temps d'acquisition est aussi remarquable puisque chaque image (512 X 512) prend moins d'une seconde. On peut donc affirmer qu'une excellente image 3D peut être obtenue en une minute. On voit tout de suite l'énorme avantage de la microscopie optique à 2 photons à comparer avec l'IRM ou le PET, tant du point de vue résolution spatiale, on est maintenant à l'échelle cellulaire, que du point de vue temps d'acquisition. On verra que cet avantage peut encore être accentué grâce à l'accès d'une large variété de colorants spécifiques de certaines fonctions biologiques. En fait, pour les expériences après irradiation, pour l'instant, la limitation principale vient uniquement du temps de déplacement de minimal (environ 1 heure) entre le synchrotron et le laboratoire de spectrométrie physique.

Le protocole d'observation mis au point repose sur la coloration de la totalité du circuit sanguin (comme pour l'angiographie oculaire humaine) par injection intravasculaire dans la queue de la souris (technique minimalement invasive). Nous utilisons maintenant systématiquement simultanément deux colorants qui répondent à plusieurs contraintes : i) excitation simultanée des 2 colorants par transitions à 2 photons à 800 nm; ii) fluorescence spectralement bien séparables ; iii) les propriétés vis à vis de la diffusion à travers la barrière hémato encéphalique (BHE) doivent être opposées pour les 2 colorants : un doit être diffusible et l'autre pas du tout. iv) finalement la toxicité doit être faible. C'est l'imagerie différentielle de ces deux colorants qui est originale : elle donne accès à la totalité du volume capillaire mais permet aussi de s'affranchir de cette contribution parfois éblouissante (via la différence) et de révéler les tissus et cellules adjacentes grâce au colorant qui à franchi la BHE (cf. figure 1)


Figure 1  Projection verticale d’une pile d’images acquises in vivo de 150 à  300 µm sous la dure mère (par pas de 2 µm) dans le cortex d’une souris Nude 48h après radiothérapie par microfaisceaux. Les quantités de colorants injectés sont: 100 µl d’une solution de 100 mg.ml-1 de FITC-dextran et 50 µl ‘une solution de 5 mg.ml-1 de sulforhodamine B. La coloration des capillaires en jaune provient de l'émission simultanée des 2 colorants alors que les "boules rouges" sont des corps cellulaires (neurones ou cellules gliales) qui ont capté le colorant diffusible uniquement lorsqu'ils ont subit l'irradiation X ( ici sous forme de surdosage en 3 bandes horizontales). Cliquer sur la figure pour agrandir.



Nous avons aussi mis au point le traitement quantitatif de ces riches images. Il donne accès à des grandeurs aussi fondamentales que : le volume capillaire et son évolution en cours de traitement, la vitesse de diffusion des colorants suivant l'état de la BHE (conjugué avec les propriétés physico chimiques des colorants) et ceci avec une résolution spatiale exceptionnelle. Les procédures mises au point sont d'une telle efficacité qu'elles pourront être appliqués en temps réels lors de l'acquisition in vivo.  

2) Ce que nous proposons de mettre en oeuvre :

En nous servant de notre expérience nous pensons qu'il est maintenant possible de nous rapprocher encore plus de la demande médicale : En premier lieu il faut observer à très court terme les effets de l'irradiation (du rayonnement synchrotron) tout d'abord sur les tissus sains du cortex puis sur des tumeurs implantés. En effet nous savons maintenant qu'il existe une réaction à très court terme (la minute) à une agression du cortex où interviennent des cellules "sentinelles". Cette réaction rapide a bien sûr d'importantes conséquences à long terme. Il est donc fondamental de tout mettre en oeuvre pour être à même de mesurer une réaction rapide à une "agression" radiothérapique en absence ou en présence de tumeurs. Le meilleur endroit pour réaliser ces expériences est certainement la ligne médicale de l'ESRF à cause de la haute qualité du faisceau X. Nous proposons donc d'y d'installer un poste de microscopie à 2 photons. Nous choisirons évidemment la coloration la moins invasive qui consistera à l'injection intravasculaire par la queue mais interviendra automatiquement les problèmes liés à la vitesse de diffusion des colorants du fait de la BHE. Dans ce domaine, tout reste à faire, alors que la diffusion de drogues à but thérapeutique est maintenant bien documentée, il n'en est rien pour les colorants pour la microscopie du cortex. Nous proposons une étude systématique des colorants prometteurs vis à vis de passage de la BHE, nous pensons qu'en premier lieu une bonne mesure du coefficient de partage Octanol/eau sera nécessaire. Plus fondamentalement nous n'hésiterons pas à mettre à contribution le savoir faire des chimistes du laboratoire d’autres avec qui nous collaborons déjà: en partant d'une famille de colorants prometteurs nous proposons d'influer la vitesse de passage de la BHE en agissant sur le caractère lipophile/hydrophile via la modulation de la longueur de bras alkyles ou de fonctions polaires (type oxyde d’éthylène).
Plus prospectif, nous proposons d'utiliser les propriétés optiques intrinsèques des tissus cérébraux . Nous savons par exemple que le collagène possède un suffisamment fort coefficient non linéaire pour permettre un imagerie qui s'appuie sur la génération de second harmonique. Ce mode de détection, offre une non-invasivité parfaite puisque aucun colorant n'est injecté. Il est aussi biologiquement pertinent puisque le collagène est intimement associé à la vascularisation cérébrale et que sa présence est souvent ciblée en histologie quantitative.
En conclusion, dans le domaine des nouvelles méthodes d’imagerie, la contribution des physiciens et chimistes à des projets biologiques et médicaux est un gage de succès. Bien souvent, en plus de l'apport immédiat dans le cadre précis du projet, d'autres retombés sont présentes: La méthode devrait pouvoir être généralisée à d'autres organes à partir du moment où la vascularisation est présente. De plus notre travail chimique sur les chromophores sera immanquablement valorisable sous forme de brevets.


Collaborations


INSERM : Unité U594 : Neuroimagerie Fonctionnelle & Métabolique

Ligne médicale de l'ESRF   (1)    et (2)

Le futur institut des Neurosciences de Grenoble  (GIN)Logo_Gin


Animations




paquet
3D
La microscopie à balayage de la luminescence excitée à 2 photons de colorant injecté dans le circuit sanguin (de la souris) autorise une tomographie optique à grande profondeur (jusqu'a 0.6 mm).
Ces petites animations sont  des reconstitutions  3D d'une pile de 100 images ( 256 µ par 256 µ) espacés de 3 µ à partir de la surface du cerveau d'une souris (résultat d'expérience par Pascale Vérant et Raphaël Serduc le 07/07/2003). C'est le traitement de ce type d'acquisition qui nous permet de remonter au volume capillaire.
A gauche un défilement tranche par tranche, comme en cours d'acquisition. A droite la reconstitution 3D à partir de ces tranches.


Rapports et thèses récents


Thèse de Pascale Vérant (Juillet 2006)
Imagerie intravitale par microscopie biphotonique : application à l'étude des effets de la radiothérapie synchrotron par microfaisceaux sur la microvascularisation corticale de la souris

la version pdf

Thèse de Raphaël Serduc (Décembre 2006)
Effets de la radiothérapie par microfaisceaux synchrotron sur la microvascularisation cérébrale saine et tumorale chez la souris (version pdf)


Rapport de DEA 2006 de Thomas Huault  : "Méthodes expérimentales de caractérisation de nouveaux marqueurs fluorescents par absorption à deux photons pour l'imagerie cellulaire in vivo"

Rapport de stage M1 2006 de Souny YEM : "Propriétés Physico-Chimiques de Colorants Organiques"

Rapport 2005 pour le laboratoire  "Analyse de la micro vascularisation cérébrale de la souris par microscopie non linéaire."


Rapport de DEA 2005 de Clément Ricard : Effets de la Radiothérapie par Microfaisceaux sur la Microvascularisation et les Tissus Cérébraux Sains et Tumoraux



Contrats

Projet Plateforme "femto" en spectro

Programme Interdisciplinaire CNRS CEA INSERM "Imagerie du Petit Animal " (2002)

CPER « Nouvelles Approches Physiques des Sciences du Vivant » Imagerie de l’angiogénèse tumorale : de la microscopie à deux photons à l’imagerie par résonance magnétique (2003).

CPER « Nouvelles Approches Physiques des Sciences du Vivant » Matériaux pour la microscopie optique non linéaire intra vitale (2005)

CPER « Nouvelles Approches Physiques des Sciences du Vivant » Nanocristauxmoléculaires fluorescents pour l’imagerie du cortex cérébral de la souris par luminescence excitée à deux photons (2005)

IdNano 2005  "Nouvelle microscopie optique non-linéaire : Depuis la mise en œuvre de nouvelles nano-sondes jusqu’à la validation sur tissus biologiques."


Posters


An intravital two photon microscopy method for imaging mouse brain tissues in the vicinity of capillaries (pdf - 0.2Mo)
Microscopie intravitale et neurosciences. Etude des effets des radiothérapies synchrotron (pdf - 0.15Mo)
Effect of microbeam radiation exposure to the microvasculature of healthy mouse brain
IPA_2006 A direct method for measuring mouse capillary cortical blood volume using multiphoton laser scanning microscopy

Multiphoton Microscroscopy as a powerfull tool  to investigate the healthy and diseased brain


Exposés récents

Exposé de Jean-Claude Vial  :  Institut Albert Boniot   Janvier 2006
Exposé de Boudewijn van der Sanden  : CEA Grenoble Décembre 2005
Exposé de Pascale Vérant "Femtosecond Laser Applications in Biology" (SPIE) Strasbourg Avril 2004 
Exposé de Pascale Vérant " Progress in Biomedical Optics and imaging - Confocal, Multiphoton and Nonlinear Microscopy Imaging II" Munich Juin 2005


Articles
A Method for Measuring Cerebral Blood Volume of Mouse using Multiphoton Laser Scanning Microscopy.
Publié dans "Femtosecond Laser Applications in Biology", edited by Sigrid Avrillier, Jean-Michel Tualle, Proceedings of SPIE Vol. 5463 (SPIE, Bellingham, WA, 2004) · 1605-7422/04/$15 · doi:10.1117/12.546334
In vivo two-photon microscopy study of short-term effects of microbeam irradiation on normal mouse brain microvasculature.
International Journal of Radiation Oncology Biology Physics  2006
A direct method for measuring mouse capillary cortical blood volume using multiphoton laser scanning microscopy
Pascale Verant , Raphael Serduc , Boudewijn Van Der Sanden , Chantal Remy and Jean-ClaudeVial
Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism(2006)


montage "Two-Photon Imaging"

Pre-print d'un article de revue.

Elastine_Collagene Pre-print de "In Vivo Imaging of Elastic Fibers using Sulforhodamine B"


BF3 Preprint de "Cell-permeant cytoplasmic blue fluorophores optimized for in vivo two-photon microscopy with low-power excitation"


Voir aussi


Un petit article  dans "le journal du CNRS" N° 186 , Juillet-Août  2005
http://www2.cnrs.fr/presse/journal/2330.htm



Sites Intéressants, documents...

***Des liens vers des sites en relation avec la microscopie intravitale.

***Docu protégée par mot de passe



Logiciels

ImageJ tournant en Applet Java

Intervenants

Clément Ricard
Pascale Vérant,
Raphël Serduc,
Jean-Claude Vial,
Jonathan Coles
Boudewijn van der Sanden,
Chantal Rémy,
Régine Farion
Patrice Baldeck
Thomas Huault
 
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