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Le sectionnement optique en microscopie amélioré grâce à l’émission stimulée

publié le

La microscopie optique, qui utilise la fluorescence de marqueurs, est incontournable pour l’imagerie d’échantillons biologiques. Le plus souvent, l’excitation et la détection se font via un seul objectif, on parle de technique d’épifluorescence. Lorsque l’échantillon est largement éclairé, l’image est faite sur l’œil via un oculaire mais maintenant de préférence sur une matrice bidimensionnelle de photodétecteurs (CCD ou CMOS), on réalise une imagerie dite de plein champ. Cette méthode est très rapide mais ne donne qu’une image bidimensionnelle de l’échantillon.

Tout en maintenant l’acquisition plein champ, l’éclairage latéral sous forme de feuillet, substitué à l’éclairage axial, procure un sectionnement optique et donc la troisième dimension. Toutefois, si on souhaite avoir des feuillets très fins, les lois de la diffraction font que son épaisseur ne sera pas uniforme.
Dans le cadre du projet « Nanoscolas » soutenu par l’ANR, en collaboration avec une équipe de l’institut des neurosciences de Grenoble (GIN), nous avons montré qu’une méthode superésolutive pouvait concilier finesse et étendue. Elle utilise deux lasers colinéaires, un pour la formation du feuillet fluorescent et l’autre pour l’éteindre sélectivement grâce à l’émission stimulée (effet STED) pourvu que le faisceau stimulant soit mis en forme via un masque de phase. Nous avons élaboré des masques de phase simples et très efficaces et démontré que des images tridimensionnelles hautement résolues de microsphères fluorescentes et de tissus biologiques pouvaient être obtenus à grande vitesse (exemple avec STED - image c et sans STED image b). Ce travail a donné lieu à une publication au sein d’une édition spéciale de « biomedical optics express ».

Voir en ligne : Improved optical slicing by stimulated emission depletion light sheet microscopy José Martínez Hernández, Alain Buisson, Irène Wang, and Jean-Claude Vial, Biomed. Opt. Express 2020